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2 GP

實驗protocol cell culture&flow preparation

作者:羽毛│2017-05-20 23:51:10│巴幣:4│人氣:418
收細胞 並數數量 接著將細胞收起 並以paraformadihyde fix 接著染一抗overnight 接著再染二抗

sub cell:(10cm dish/ 7cc medium /dish)
prewarm pbs medium(10%FBS hyclone 1x DMEM) trypsin(FBS可終止作用)
將舊medium 吸起 放在空離心管(一種細胞一隻pipet 再加上medium與pbs各一隻)
以4、5cc pbs wash twice

以兩倍trypsin吸500~1000之間的量加入dish.(for 5 ~8minutes don't above 8 minutes)

用剛剛吸起來的舊medium加入dish中去中和trypsin 並沖下細胞

把細胞液全部放入剛剛放舊medium的離心管中 接著離心1000轉 3 mins for15cc 5mins for50 cc


接著有兩種處理方式
1.要sub回盤子
2.數細胞並收回準備flow

1.將剛剛的盤子以pbs wash twice
把剛剛離心後的離心管的液體吸掉 以1000接300的去吸
接著把細胞沉積物含管子在網子上刮一下

加入1cc pbs回去 並取一些回去盤子 直到裡面大約含2、3成細胞

2.加入適量pbs讓自己好數為主
數完後的濃度取自己所需的量 再補pbs到需要之總體積再分管

以這次實驗舉例 每管我們要200ul的量 而裡面每管要有3×10*5的細胞數 看看需要原本管內多少細胞 剩下吸掉
把細胞拿到隔壁(非culture room)
加入0.1%paraformadihyde fix 10~15mins
離心2000rpm 5mins

接著用pbs wash twice 一樣離5分鐘

以FACS buffer回溶每管200ul
加入每管抗體所需濃度 並染overnight(以小摩天輪)
隔天先spin down 並加入1cc pbs wash twice(以1500rpm 5mins離心)
倒掉sup
加入FACS 1cc 並離心(以1500rpm 5mins離心)
加入二抗1:500 每管只需要100ul in FACS即可
避光30分鐘

另外 若要種12well的話 一格1.5×10^5 cells in 500ul total volume
引用網址:https://home.gamer.com.tw/TrackBack.php?sn=3583008
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